TP – Initiation aux manipulations de microbiologie

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    NIHA
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    TP – Initiation aux manipulations de microbiologie

    Message par NIHA le Ven 1 Mai - 18:32

    I-Mise en évidence de la présence de micro-organismes au laboratoire

    Séance 1

    Prendre 3 milieux gélosés en boite de Petri :
    -diviser la boite n°1 en 2 secteurs : déposer un cheveu sur le premier et quelques gouttes d’eau du robinet sur le second.
    -diviser la boite n°2 en 4 secteurs : appliquer une trace de doigt sur le premier, refaire l’opération sur le second après s’être lavé les mains, déposer une pièce de monnaie sur le troisième, frotter un écouvillon sur la paillasse et appliquer celui-ci sur le dernier secteur.
    -laisser la troisième boite ouverte au dessus de la paillasse (environ 10 min).

    Remarque : une série de 5 boites de Petri de 8cm de diamètre est laissée ouverte sur une paillasse près d’un bec Bunsen allumé.

    Séance 2

    Exploitation des boites de Petri de la séance précédente -

    II-Les manipulations stériles

    Tous les instruments du microbiologiste devront être stériles et utilisés dans la zone de travail stérile créée par le bec Bunsen (zone d’environ 30 cm de diamètre). Les prélèvements et les transferts de produits devront être effectués dans cette zone stérile.

    Définitions liées à la gestion des micro-organismes :

    1-Stérilisation :

    2-Décontamination :

    1-Organisation du poste de travail

    Le poste de travail de microbiologie met en jeu une organisation précise des différents matériels. Cette organisation doit être ergonomique afin de garantir la stérilité du travail.

    2-Organisation du travail

    Le microbiologiste doit travailler stérilement et pour cela il doit respecter des gestes méthodiques précis :

    -nettoyer la paillasse avec une solution désinfectante (Eau de Javel).

    -se laver les mains.

    -travailler assis, sans gestes brusques pour éviter tout brassage d’air, ne pas parler et éviter de tousser.

    -d’une façon générale, la main qui maintient dans la zone aseptique l’ensemenceur métallique ou la pipette Pasteur ne doit pas se déplacer. Tout le matériel nécessaire (tubes, boîtes de Petri) doit être amené à l’aide de l’autre main. Ainsi il n’y aura jamais aucun croisement entre les deux mains pour éviter tout brassage d’air et nuire à la stérilité.

    -les tubes et les flacons après ouverture ne seront jamais tenus verticalement mais obliquement avec leur ouverture dirigée vers la flamme du bec Bunsen. L’orifice d’ouverture des tubes et flacons sera stérilisé par un passage dans la flamme du bec Bunsen lors de leur ouverture et lors de leur fermeture.

    -tout le matériel sera annoté soigneusement pour éviter les risques de confusion : nom, date, référence de l’échantillon.

    -après la manipulation, tout le matériel souillé doit être rassemblé dans les récipients prévus à cet effet en vue de sa décontamination pour être ensuite recyclé ou éliminé.

    -nettoyage des mains et de la paillasse en fin de manipulation.

    III-Manipulations

    1-Vérification de la stérilité du travail

    a-Préparation d’un milieu de culture

    Prendre un flacon de milieu de culture gélosé (maintenu en surfusion à 55°C), et couler à l’aide de celui-ci deux boîtes de Petri de manière à obtenir une épaisseur de milieu d’environ 4 mm. Laisser le milieu gélosé se solidifier.

    b-Transfert de liquide de tube à tube

    On cherche à transférer à l’anse de platine une goutte d’eau stérile dans un milieu de culture en bouillon stérile aussi. Après incubation, le bouillon ne devrait montrer aucun signe de développement bactérien si le transfert à été effectué en conditions stériles.

    Effectuer stérilement le transfert d’une goutte d’eau stérile à l’anse de platine dans un bouillon de culture pour bactéries :

    -prendre l’anse de platine et stériliser celle-ci par flambage au bec Bunsen.
    -effectuer grâce à l’anse de platine le prélèvement d’eau stérile et transférer celle-ci dans le bouillon.
    -homogénéiser le bouillon par mouvement de rotation du poignet.
    -reposer le tube dans le portoir.
    -stériliser l’anse de platine et reposer celle-ci dans le verre à pied.

    2-Repiquage d’une culture bactérienne

    On dispose d’une culture bactérienne en tube de 5 mL que l’on souhaite repiquer sur un milieu de culture stérile. Réaliser ce repiquage de manière stérile.

    Incubation

    A la fin de la manipulation, regrouper les différents tubes de la salle dans un portoir, et placer tubes et boîtes de Petri à l’étuve à 37°C / 24 heures.

    Remarque : pour éviter que l’eau de condensation dans les boîtes de Petri perturbe la surface du milieu gélosé, on place les boîtes en position retournée dans l’étuve.


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